酵母質(zhì)粒直接電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌體系

摘要

研究探索酵母質(zhì)粒直接電轉(zhuǎn)化大腸桿菌的高效體系。采用威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀，結(jié)合優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)流程，實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒高效轉(zhuǎn)入。結(jié)果表明，該儀器通過(guò)智能脈沖技術(shù)與精準(zhǔn)參數(shù)控制，顯著提升轉(zhuǎn)化效率，為原核細(xì)胞基因操作提供可靠方案。

引言

在基因工程研究中，將外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。電轉(zhuǎn)化法憑借其適用范圍廣、轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)勢(shì)，在原核與真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移中得到廣泛應(yīng)用。酵母質(zhì)粒作為重要的基因載體，其向大腸桿菌的高效轉(zhuǎn)化對(duì)于基因克隆、蛋白表達(dá)等后續(xù)研究至關(guān)重要。傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法在參數(shù)控制和細(xì)胞保護(hù)方面存在一定局限，而威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的出現(xiàn)，為解決這些問(wèn)題提供了新的可能。該儀器采用先進(jìn)的方波脈沖技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)高強(qiáng)度電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜通透性的瞬時(shí)重塑，結(jié)合全波形智能監(jiān)控與預(yù)編程優(yōu)化系統(tǒng)，能精準(zhǔn)控制實(shí)驗(yàn)條件，提升復(fù)雜場(chǎng)景下的轉(zhuǎn)化成功率。本文詳細(xì)介紹利用該儀器進(jìn)行酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)體系，為相關(guān)研究提供參考。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

1. 菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)鑒定無(wú)雜菌污染），含目標(biāo)基因的酵母質(zhì)粒（由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存，質(zhì)粒濃度通過(guò)核酸蛋白檢測(cè)儀精確測(cè)定為 500 ng/μL）。

2. 試劑：某試劑（用于配制電轉(zhuǎn)緩沖液，具體成分為 10 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1 mM EDTA，10% 甘油），LB 培養(yǎng)基（含 10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，固體培養(yǎng)基添加 15 g/L 瓊脂），氨芐青霉素（工作濃度 100 μg/mL，用于篩選陽(yáng)性克隆）。

3. 儀器：威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀（配備專(zhuān)用電轉(zhuǎn)杯，間隙 0.2 cm），高速離心機(jī)（某品牌，型號(hào) XXX，用于細(xì)胞離心），恒溫?fù)u床（某品牌，型號(hào) XXX，用于細(xì)菌培養(yǎng)），超凈工作臺(tái)（某品牌，型號(hào) XXX，確保無(wú)菌操作環(huán)境）。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備：從 LB 固體培養(yǎng)基上挑取單菌落大腸桿菌，接種于 5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日以 1:100 的比例轉(zhuǎn)接至 50 mL LB 液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至 OD600 為 0.4-0.6（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）。將菌液冰浴 30 分鐘，4℃、4000 r/min 離心 10 分鐘，棄上清。用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液重懸菌體，重復(fù)離心洗滌 2 次，最終用適量電轉(zhuǎn)緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)整為 1×10^10 CFU/mL，冰上保存?zhèn)溆谩?/span>

2. 質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混合：取 50 μL 制備好的感受態(tài)細(xì)胞，加入 1 μL 酵母質(zhì)粒（500 ng），輕輕吸打混勻，冰浴 5 分鐘，使質(zhì)粒與細(xì)胞充分接觸。

3. 電轉(zhuǎn)化參數(shù)設(shè)置與操作：打開(kāi)威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀，進(jìn)入操作界面。由于大腸桿菌屬于原核細(xì)胞，根據(jù)儀器內(nèi)置的預(yù)編程優(yōu)化系統(tǒng)，一鍵調(diào)用原核細(xì)胞電轉(zhuǎn)參數(shù)（該參數(shù)庫(kù)經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，包含多種常用原核細(xì)胞株的最佳電轉(zhuǎn)條件）。將混合好的細(xì)胞與質(zhì)粒樣品加入電轉(zhuǎn)杯中，確保電極間距內(nèi)無(wú)氣泡。使用腳踏開(kāi)關(guān)啟動(dòng)電轉(zhuǎn)程序，儀器 10 英寸觸控屏實(shí)時(shí)顯示脈沖波形與參數(shù)動(dòng)態(tài)，可直觀觀察電轉(zhuǎn)過(guò)程。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，立即向電轉(zhuǎn)杯中加入 950 μL 預(yù)冷的 LB 培養(yǎng)基，輕輕混勻，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中，37℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng) 1 小時(shí)，使細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)。

4. 陽(yáng)性克隆篩選：將復(fù)蘇后的菌液離心，棄部分上清，留約 100 μL 菌液重懸，均勻涂布于含氨芐青霉素的 LB 固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)鑒定。

結(jié)果與討論

1. 轉(zhuǎn)化效率分析

通過(guò)對(duì)涂布平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算得出轉(zhuǎn)化效率為 5×10^8 CFU/μg 質(zhì)粒 DNA。與傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法相比，利用威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化，效率提升超過(guò) 40%（基于內(nèi)部測(cè)試數(shù)據(jù)）。這得益于儀器的方波脈沖技術(shù)，能夠瞬時(shí)高強(qiáng)度電場(chǎng)作用于細(xì)胞膜，有效重塑膜通透性，使質(zhì)粒 DNA 高效進(jìn)入細(xì)胞。同時(shí)，儀器的智能阻抗檢測(cè)功能在預(yù)脈沖階段自動(dòng)測(cè)量樣品電阻，動(dòng)態(tài)調(diào)整參數(shù)，確保每次電擊條件與細(xì)胞狀態(tài)匹配，避免了因參數(shù)不合適導(dǎo)致的細(xì)胞損傷或轉(zhuǎn)化效率低下問(wèn)題。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程可控性與重復(fù)性

在電轉(zhuǎn)過(guò)程中，儀器的全波形智能監(jiān)控系統(tǒng)實(shí)時(shí)顯示脈沖波形，研究者可直觀了解電轉(zhuǎn)過(guò)程中的電壓、時(shí)長(zhǎng)等參數(shù)變化，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程透明可控。此外，儀器支持自定義保存 600 條實(shí)驗(yàn)方案，本次實(shí)驗(yàn)參數(shù)可準(zhǔn)確保存，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)直接調(diào)用，極大提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。歷史記錄查詢(xún)功能可追溯 100 條過(guò)往實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，便于研究者進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比與分析，為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件提供依據(jù)。

3. 儀器安全性與操作便捷性

威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的電弧防護(hù)設(shè)計(jì)，有效杜絕了電弧對(duì)細(xì)胞和儀器的損傷，保障了實(shí)驗(yàn)的安全性。極性反轉(zhuǎn)技術(shù)突破了細(xì)胞膜電荷屏障，對(duì)于一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株也能顯著提升轉(zhuǎn)化成功率。腳踏開(kāi)關(guān)的設(shè)計(jì)解放了雙手，使研究者在進(jìn)行電轉(zhuǎn)操作的同時(shí)，可同步進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)現(xiàn)多任務(wù)并行操作。模塊化設(shè)計(jì)使其能夠兼容活體組織、離體樣本及微量體系，滿足不同實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景的需求。

結(jié)論

研究建立的酵母質(zhì)粒直接電轉(zhuǎn)化大腸桿菌體系，借助威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的先進(jìn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效、精準(zhǔn)的基因轉(zhuǎn)移。該儀器在轉(zhuǎn)化效率、實(shí)驗(yàn)可控性、安全性和操作便捷性等方面表現(xiàn)出色，為原核細(xì)胞基因操作提供了可靠的技術(shù)支持。無(wú)論是基礎(chǔ)研究中的基因編輯、蛋白表達(dá)，還是工業(yè)領(lǐng)域的工程菌構(gòu)建，該儀器都展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。如需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案或了解儀器詳情，歡迎隨時(shí)咨詢(xún)。

參考文獻(xiàn)

1. 制備高效大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和電轉(zhuǎn)化條件的研究 [J] . 朱森康 ,黃磊 ,李燕飛 . 生物技術(shù)通報(bào) . 2011,第10期

2. 納豆激酶基因重組質(zhì)粒在大腸桿菌與畢赤酵母中的穩(wěn)定性 [J] . 黃志立 ,羅立新 ,楊汝德 . 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào) . 2001,第4期

3. 從酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到大腸桿菌快速穿梭質(zhì)粒制備法 [J] . Kaise.P ,陳兆磊 . 藥學(xué)進(jìn)展 . 1993,第3期

4. 一株無(wú)內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌的電轉(zhuǎn)化條件 [J] . 楊涓 ,呂常江 ,羅麥琪 . 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào) . 2016,第6期

5. 多殺性巴氏桿菌同源重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化條件研究 [J] . 李國(guó)攀 ,榮俊 . 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然版）理工卷 . 2015,第9期