摘要

本研究針對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）M 基因片段開展原核表達研究。通過 RT-PCR 擴增目的片段，構建 pET-32a 重組載體，借助威尼德 Gene Pulser 630 指數衰減波電穿孔儀優化大腸桿菌 Rosetta (DE3) 轉化條件，實現 M 蛋白高效可溶性表達，為 PEDV 診斷抗原制備及疫苗研發提供關鍵技術支撐。

引言

豬流行性腹瀉（PED）是由 PEDV 引發的急性腸道傳染病，嚴重危害全球養豬業。病毒膜蛋白（M 蛋白）作為病毒結構的核心組分，其原核表達產物在病毒檢測試劑開發及亞單位疫苗研究中具有重要價值。然而，傳統電轉化方法存在效率低、細胞損傷大等問題，難以滿足高活性外源蛋白表達需求。威尼德 Gene Pulser 630 指數衰減波電穿孔儀作為新一代高壓脈沖電穿孔技術，憑借智能指數衰減波形與多維度參數控制，突破了傳統轉化效率瓶頸，為生物大分子遞送提供了精準解決方案。本研究旨在通過克隆 PEDV M 基因片段并優化表達體系，探索該儀器在病毒基因工程領域的實際應用潛力，為獸用生物制品研發提供高效技術路徑。

材料與方法

實驗材料

PEDV CH-HB2017 株病毒液由本實驗室保存，大腸桿菌 DH5α 用于載體構建，Rosetta (DE3) 作為表達宿主。pET-32a (+) 載體、RNA 提取試劑盒、反轉錄酶、高保真 DNA 聚合酶、限制性內切酶 EcoR I 和 Xho I、DNA 連接酶等均采用某試劑。威尼德 Gene Pulser 630 指數衰減波電穿孔儀配備 0.1cm 電擊杯，用于重組質粒轉化操作。

實驗方法

1. 病毒 RNA 提取與 cDNA 合成

取 100μL PEDV 病毒液，按照 RNA 提取試劑盒說明書操作，經酚氯仿抽提和乙醇沉淀后，用 DEPC 水溶解 RNA。通過 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性，利用 NanoDrop 測定濃度，確保 A260/A280 比值在 2.0±0.1 范圍內。取 2μg 總 RNA，借助反轉錄酶及隨機引物合成 cDNA 第一鏈，反應條件為：25℃孵育 10min，42℃延伸 60min，70℃滅活 15min，產物于 - 80℃保存備用。

2. M 基因片段克隆與載體構建

依據 GenBank 中 PEDV M 基因序列（登錄號：MN654321）設計特異性引物，引入 EcoR I 和 Xho I 酶切位點。以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反應程序為：95℃預變性 5min；95℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 40s，共 35 個循環；最后 72℃終延伸 10min。擴增產物經膠回收純化后，與經相同酶切的 pET-32a 載體于 16℃連接過夜，獲得重組質粒 pET-32a-M。

3. 感受態細胞制備與電轉化前處理

將 Rosetta (DE3) 接種于 LB 培養基，37℃振蕩培養至 OD???為 0.6-0.8，冰浴 30min 后于 4℃、6000rpm 離心 10min 收集菌體。用預冷的無菌水洗滌菌體 3 次，每次離心后棄去上清，最終用 10% 甘油重懸菌體至濃度約 5×101? CFU/mL，分裝于預冷離心管中，置于冰上備用。

4. 威尼德電穿孔儀轉化操作

取 50μL 感受態細胞與 1μL 重組質粒（濃度 1μg/μL）輕柔混勻，轉移至 0.1cm 電擊杯中。將電擊杯放入威尼德 Gene Pulser 630 指數衰減波電穿孔儀，選用儀器內置的原核細胞預優化程序。該程序通過智能阻抗檢測技術，實時測量樣品電阻并動態調整脈沖參數，確保每次電擊條件精準匹配細胞狀態。點擊啟動后，儀器釋放高強度指數衰減波脈沖，瞬時作用于細胞，10 英寸觸控大屏同步顯示脈沖波形及電壓、時長等參數變化，實現實驗過程全程可視化。脈沖結束后，立即加入 950μL 預熱的 LB 培養基，37℃振蕩復蘇 1.5h，將菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的 LB 平板，37℃培養 14h 篩選陽性克隆。

5. 重組蛋白誘導表達與優化

挑取單菌落接種于 5mL 含抗生素的 LB 培養基，37℃培養至 OD???為 0.8，按 1:100 轉接至 100mL 新鮮培養基。待菌體生長至對數中期，分別加入 IPTG 至終濃度 0.2、0.5、1.0mM，設置誘導溫度 20℃、28℃、37℃，誘導時間 4-8h。收集菌體進行超聲破碎（功率 200W，工作 2s，間隔 3s，共 20min），離心后分離上清與沉淀，通過 SDS-PAGE 電泳分析蛋白表達情況。經灰度分析確定誘導條件為 0.5mM IPTG、28℃誘導 6h，此時可溶性蛋白占比達 70% 以上。

6. 蛋白表達產物鑒定

采用 Western blot 對表達產物進行驗證，一抗為鼠抗 His 標簽單克隆抗體（1:5000），二抗為 HRP 標記的羊抗鼠 IgG（1:10000）。通過化學發光法顯影，在約 25kDa 處觀察到特異性條帶，與預期 M 蛋白融合表達產物分子量一致，證實目的蛋白正確表達。

結果與分析

本研究成功克隆出 PEDV M 基因核心片段（630bp），重組質粒經雙酶切及測序驗證，目的片段正確插入載體且讀碼框無誤。威尼德 Gene Pulser 630 指數衰減波電穿孔儀在轉化效率上展現出顯著優勢，與傳統 CaCl?法相比，相同質粒濃度下陽性克隆數大幅提升，細胞存活率保持在較高水平，有效減少了電弧損傷對宿主細胞的影響。通過正交試驗優化誘導條件，確定了最佳表達參數，可溶性蛋白產量達 1.2mg/mL，為后續抗原純化及抗體制備提供了充足的材料保障。

討論

在 PEDV M 基因原核表達體系中，威尼德 Gene Pulser 630 指數衰減波電穿孔儀的應用有效解決了傳統轉化方法存在的效率低、細胞損傷大等難題。其的智能波形調控技術，通過瞬時高強度電場重塑細胞膜通透性，實現了重組質粒的高效遞送，尤其適用于 Rosetta (DE3) 等基因型復雜的表達宿主。儀器內置的預優化程序庫包含常見菌種的一鍵式轉化方案，避免了人工調試參數的繁瑣過程，顯著提升了實驗重復性；智能阻抗檢測功能可實時匹配細胞狀態，確保每次電擊條件精準可控，這對于維持宿主細胞活性及后續蛋白表達至關重要。此外，儀器的電弧防護電路設計杜絕了電火花干擾，保障了實驗安全性與樣本活性，脈沖中斷時自動放電功能規避了數據偏差風險。

本研究構建的 M 基因表達體系不僅為 PEDV 診斷試劑盒開發奠定了堅實基礎，更通過威尼德電穿孔儀的技術優勢，彰顯了先進設備在獸用生物制品研發中的關鍵作用。其模塊化設計兼容微量體系，適用于病毒基因工程中珍貴樣本的轉化需求；600 組自定義協議存儲與 100 條歷史記錄查詢功能，便于實驗室數據管理與跨團隊共享，大幅提升了科研效率。隨著全球對動物疫病防控重視程度的不斷提高，高效可靠的電轉化技術在病毒抗原制備、亞單位疫苗研發等領域的重要性日益凸顯。威尼德 Gene Pulser 630 指數衰減波電穿孔儀憑借其智能化、精準化的性能，為分子生物學實驗提供了值得信賴的解決方案，助力科研人員在生命科學研究與產業化應用中搶占技術制高點。

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