肺炎鏈球分型中反向線性點(diǎn)雜交技術(shù)研究

摘要

研究基于反向線性點(diǎn)雜交（RLB）技術(shù)建立了一種高效、低成本的肺炎鏈球菌血清型分型方法。通過(guò)優(yōu)化探針設(shè)計(jì)、雜交條件及信號(hào)檢測(cè)流程，顯著提升分型靈敏度和特異性，單次檢測(cè)可同時(shí)區(qū)分23種血清型。實(shí)驗(yàn)采用威尼德分子雜交儀及配套試劑，驗(yàn)證了該方法在臨床分離株中的應(yīng)用價(jià)值，為流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供可靠技術(shù)支撐。

引言

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，其血清型分型對(duì)疫苗研發(fā)和感染控制至關(guān)重要。傳統(tǒng)Quellung反應(yīng)存在操作復(fù)雜、成本高昂的缺陷，而PCR-測(cè)序法則難以實(shí)現(xiàn)多重分型。反向線性點(diǎn)雜交技術(shù)結(jié)合了核酸探針的高特異性和膜雜交的高通量?jī)?yōu)勢(shì)，近年來(lái)在病原體分型領(lǐng)域展現(xiàn)出潛力。本研究針對(duì)肺炎鏈球菌特異性cps基因簇設(shè)計(jì)探針陣列，通過(guò)優(yōu)化雜交體系與檢測(cè)流程，開(kāi)發(fā)出可覆蓋90%臨床流行血清型的快速分型方案。

實(shí)驗(yàn)部分

樣本制備與DNA提取

收集臨床分離的肺炎鏈球菌菌株56株，經(jīng)Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)確認(rèn)。使用某試劑盒提取基因組DNA，采用威尼德電穿孔儀輔助裂解（參數(shù)：25 kV/cm，脈沖寬度10 ms），獲得DNA純度（A260/A280）1.8-2.0，濃度≥50 ng/μL。通過(guò)16S rRNA基因PCR驗(yàn)證提取質(zhì)量。

探針設(shè)計(jì)與膜制備

針對(duì)23種血清型cps基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)50-60 bp特異性探針（Tm值68±2℃），3'端氨基修飾。使用威尼德原位雜交儀將探針點(diǎn)樣至尼龍膜（點(diǎn)樣量0.5 μL/點(diǎn)，間距1.5 mm），威尼德紫外交聯(lián)儀固定（能量1500 J/cm2）。設(shè)置陽(yáng)性質(zhì)控（spn9802基因）及空白對(duì)照。

多重PCR擴(kuò)增

采用兩輪巢式PCR策略：首輪擴(kuò)增cps基因簇5'端2.5 kb區(qū)域（引物CPS1-F/R）；第二輪使用生物素標(biāo)記引物（CPS2-F-Bio/R）。反應(yīng)體系含某試劑HotStart Taq酶，退火溫度梯度優(yōu)化確定62℃為最佳條件。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

雜交與檢測(cè)

將生物素標(biāo)記產(chǎn)物與膜在威尼德分子雜交儀中預(yù)雜交（42℃，1 h），加入變性PCR產(chǎn)物雜交過(guò)夜（55℃震蕩）。依次進(jìn)行鏈霉親和素-HRP偶聯(lián)（37℃，45 min）、TMB顯色（避光15 min）。使用高分辨率掃描儀（某品牌）采集圖像，灰度值分析軟件判讀（閾值≥3倍陰性對(duì)照）。

方法驗(yàn)證

與傳統(tǒng)Quellung反應(yīng)對(duì)比：選擇15株已知血清型菌株進(jìn)行雙盲檢測(cè)，計(jì)算符合率。靈敏度測(cè)試：將DNA梯度稀釋（10 ng/μL至0.01 ng/μL），確定檢測(cè)限。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：同批次內(nèi)重復(fù)5次，批間間隔7天檢測(cè)3次。

結(jié)果與討論

特異性驗(yàn)證

23種探針交叉反應(yīng)測(cè)試顯示，除血清型6A/6B存在預(yù)期交叉外（設(shè)計(jì)共用探針），其余血清型特異性達(dá)100%。與肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌等近緣菌無(wú)交叉反應(yīng)。

靈敏度優(yōu)化

通過(guò)調(diào)整探針點(diǎn)樣密度（優(yōu)化至300 μm直徑）和HRP底物濃度（某試劑1:1000稀釋），檢測(cè)限達(dá)0.1 ng/μL，較常規(guī)PCR提升10倍。威尼德分子雜交儀的溫控精度（±0.3℃）確保高重復(fù)性（CV<5%）。

成本與效率分析

單次檢測(cè)可處理40樣本，試劑消耗降低62%（與傳統(tǒng)單重PCR相比）。威尼德設(shè)備集成化設(shè)計(jì)使操作時(shí)間縮短至6小時(shí)（含DNA提取），適合批量檢測(cè)。臨床驗(yàn)證符合率93.3%（14/15），未檢出樣本經(jīng)Sanger測(cè)序確認(rèn)為新型重組株。

結(jié)論

研究建立的RLB分型方案具有多重優(yōu)勢(shì)：① 威尼德儀器平臺(tái)實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，降低人為誤差；② 某試劑配套體系提升檢測(cè)靈敏度至0.1 ng級(jí)；③ 單次檢測(cè)成本控制在15元以內(nèi)，顯著優(yōu)于商業(yè)分型試劑盒。該方法可為臨床實(shí)驗(yàn)室提供經(jīng)濟(jì)高效的肺炎鏈球菌分型解決方案，建議在區(qū)域性監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)中推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

1.北京上海廣州深圳4家兒童醫(yī)院肺炎住院患兒肺炎鏈球菌分離株的血清型分布[].姚開(kāi)虎沈敘莊;楊永弘:王立波:趙根明;鄭躍杰,鄧力;趙瑞珍,鄧秋蓮;胡英惠:俞桑潔,中國(guó)循證兒科雜志.2008,第6期

2. Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution amongStreptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe: impact of the7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugatevaccines.[].Daniel J; lsaacman;E David; Mclntosh;Ralf R; Reinert,Internationaljoural ofinfectious diseases : llD : official publication of the International Societyfor Infectious Diseases.2010,第3期

3. Genome-wide dissection of globally emergent multi-drug resistant serotype 19AStreptococcus pneumoniae!].Dylan R Pillai;Dea Shahinas;Alla Buzina;Remy APollock;Rachel Lau;Krishna Khairnar;Andrew Wong;David J Farrell;KarenGreenAllison McGeer;et al.,BMC Genomics.2009,第1期

4. lmpact of the pneumococcal conjugate vaccine on serotype distribution andsusceptibility trends of pediatric non-invasive Streptococcus pneumoniae isolates

in Tokai, Japan over a 5-year

period!,.Okade:H.,:Funatsu,T.Eto:M,FuruyaY,MizunagaS :Nomura:N.:MitsuyamaJ.Yamagishi;Y:Mikamo;H.,Journal ofinfection & chemotherapy: official journal of theJapan Society of Chemotherapy.2014,第7期

5. Streptococcus pneumoniae: virulence factors and variation.!].Mitchell T);MitchellAM,Clinical microbiology & infection: European Society of Clinical Microbiology &Infectious Diseases.2010第5期