摘要

研究旨在構(gòu)建高效表達(dá)人卵泡抑素（hFS）的重組巴斯德畢赤酵母工程菌。通過基因合成、質(zhì)粒構(gòu)建及電穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)，將hFS基因整合至酵母基因組中，篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子并優(yōu)化表達(dá)條件。采用某試劑進(jìn)行蛋白純化及Western blot驗(yàn)證，最終獲得可溶性hFS蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，工程菌在甲醇誘導(dǎo)下可實(shí)現(xiàn)hFS高效表達(dá)，為后續(xù)規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

引言

人卵泡抑素（hFS）是一種糖蛋白激素，在生殖調(diào)控、細(xì)胞分化及代謝疾病治療中具有重要應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成本高且效率低，而巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）憑借其強(qiáng)啟動(dòng)子、高分泌效率及易于高密度發(fā)酵等優(yōu)勢(shì)，成為重組蛋白表達(dá)的理想宿主。目前，hFS在酵母系統(tǒng)中的表達(dá)仍面臨基因整合效率低、翻譯后修飾差異等問題。

研究通過優(yōu)化基因合成與質(zhì)粒設(shè)計(jì)，利用威尼德電穿孔儀提高轉(zhuǎn)化效率，結(jié)合多拷貝篩選策略，構(gòu)建高效表達(dá)hFS的工程菌株。同時(shí)系統(tǒng)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，提升目標(biāo)蛋白產(chǎn)量與活性，為hFS的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

1. 宿主菌：巴斯德畢赤酵母GS115（His-表型）。

2. 表達(dá)載體：pPIC9K，含AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子及α-factor信號(hào)肽序列。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

1. YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

2. BMGY/BMMY培養(yǎng)基：用于酵母預(yù)培養(yǎng)及甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。

某試劑限制性內(nèi)切酶、連接酶及DNA純化試劑。

某試劑His標(biāo)簽純化柱及Western blot檢測(cè)試劑。

1.3 hFS基因合成與質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)GenBank中hFS基因序列（登錄號(hào)：NM_001465），優(yōu)化密碼子以適應(yīng)酵母偏好性，化學(xué)合成全基因序列。

采用某試劑限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶切pPIC9K載體，與hFS基因片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-hFS。

通過威尼德分子雜交儀驗(yàn)證質(zhì)粒完整性，并測(cè)序確認(rèn)。

1.4 電穿孔轉(zhuǎn)化與多拷貝篩選

將線性化質(zhì)粒pPIC9K-hFS（經(jīng)Sal I酶切）通過威尼德電穿孔儀導(dǎo)入GS115感受態(tài)細(xì)胞，參數(shù)設(shè)置為：電壓1500 V，脈沖時(shí)間5 ms。

轉(zhuǎn)化液涂布MD平板（1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%葡萄糖），30℃培養(yǎng)3天。

高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選：依次使用含0.5、1.0、2.0 mg/mL某試劑G418的YPD平板梯度篩選，挑取抗性菌株。

1.5 表達(dá)條件優(yōu)化

初篩菌株接種至BMGY培養(yǎng)基（30℃、250 rpm），OD600達(dá)6時(shí)轉(zhuǎn)至BMMY培養(yǎng)基（含0.5%甲醇），每24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度1%。

優(yōu)化參數(shù)：誘導(dǎo)溫度（20℃、25℃、30℃）、初始pH（5.0、6.0、7.0）、甲醇補(bǔ)加濃度（0.5%、1.0%、1.5%）。

離心收集上清，某試劑BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.6 蛋白純化與鑒定

上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，加載至某試劑Ni-NTA親和層析柱，洗脫液含250 mM咪唑。

SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)：使用某試劑抗hFS單克隆抗體（1:2000稀釋），威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行膜轉(zhuǎn)印。

結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化驗(yàn)證

酶切及測(cè)序結(jié)果表明，hFS基因正確插入pPIC9K載體。

威尼德原位雜交儀檢測(cè)顯示，高拷貝菌株基因組中整合3-5個(gè)hFS表達(dá)盒。

2.2 表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

最適誘導(dǎo)溫度為25℃，初始pH 6.0，甲醇濃度1.0%。

在此條件下，hFS表達(dá)量達(dá)120 mg/L，較未優(yōu)化組提高2.3倍。

2.3 蛋白純化與活性分析

Ni-NTA純化后獲得單一目的條帶（約35 kDa），純度>90%。

Western blot顯示特異性結(jié)合信號(hào)，證實(shí)為完整hFS蛋白。

討論

研究通過優(yōu)化基因整合策略與誘導(dǎo)條件，顯著提升了hFS在畢赤酵母中的表達(dá)效率。威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)化效率（>10^5 CFU/μg DNA）對(duì)多拷貝菌株篩選至關(guān)重要。此外，低溫誘導(dǎo)（25℃）可能通過減緩蛋白折疊壓力，提高可溶性表達(dá)比例。后續(xù)研究需進(jìn)一步驗(yàn)證hFS的糖基化修飾及生物活性。

結(jié)論

成功構(gòu)建高效表達(dá)人卵泡抑素的重組巴斯德畢赤酵母工程菌，優(yōu)化后蛋白產(chǎn)量達(dá)120 mg/L，純度符合應(yīng)用要求。本實(shí)驗(yàn)為hFS的規(guī)模化生產(chǎn)及功能研究提供了可靠技術(shù)平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)

1. 尤漢寧,李定國,黃新,等.人卵泡抑素基因全長cDNA的克隆[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2004,(1).DOI:10.3969/j.issn.1674-8115.2004.01.006 .

2. 黃新,李定國,陸漢明,等.激活素和卵泡抑素mRNA在肝纖維化形成過程中的作用[J].中華肝臟病雜志.2002,(2).DOI:10.3760/j.issn:1007-3418.2002.02.001 .

3. 黃新,李定國,王志榮,等.肝纖維化形成過程中激活素A的表達(dá)變化[J].中華消化雜志.2001,(6).DOI:10.3760/j.issn:0254-1432.2001.06.007 .

4. Evans LW,Hughes RD.Activin A and follistatin in acute liver failure.[J].European journal of gastroenterology & hepatology.2003,15(2).

5. Wankell M,Goppelt A,Hans W,等.Impaired wound healing in transgenic mice overexpressing the activin antagonist follistatin in the epidermis.[J].The EMBO Journal.2001,20(19).

6. Ohga E.,Teramoto S.,Ouchi Y.,等.Activin receptors are expressed on human lung fibroblast and activin A facilitates fibroblast-mediated collagen gel contraction[J].中國科學(xué)C輯（英文版）.2000,66(17).

7. Kimitaka Kogure,You-Qing Zhang,Akito Maeshima,等.The role of activin and transforming growth factor-β in the regulation of organ mass in the rat liver[J].Hepatology.2000,31(4).916-921.