cMet基因siRNA慢病毒載體構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選研究

更新時間：2025-03-18 點擊次數(shù)：139

摘要

cMet基因的siRNA慢病毒載體，并通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選獲得高效抑制cMet表達(dá)的細(xì)胞模型。實驗采用分子克隆技術(shù)設(shè)計特異性siRNA序列，利用威尼德電穿孔儀完成病毒包裝，經(jīng)熒光標(biāo)記篩選及Western blot驗證，成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。結(jié)果顯示，cMet蛋白表達(dá)顯著降低，為后續(xù)功能研究提供了可靠工具。

引言

cMet基因編碼的肝細(xì)胞生長因子受體（HGFR）在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其異常激活與多種癌癥不良預(yù)后密切相關(guān)，因此靶向cMet的基因沉默技術(shù)成為研究熱點。siRNA介導(dǎo)的基因干擾具有高特異性，但傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法存在效率低、表達(dá)不穩(wěn)定的缺陷。慢病毒載體因其高效整合和長期表達(dá)的特性，為建立穩(wěn)定基因沉默模型提供了理想解決方案。cMet特異性siRNA慢病毒載體，結(jié)合威尼德紫外交聯(lián)儀等精密儀器優(yōu)化轉(zhuǎn)染流程，篩選獲得穩(wěn)定抑制cMet的細(xì)胞系，為腫瘤機制研究與藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建
設(shè)計針對cMet mRNA的siRNA序列（靶點：5'-AAGGUCAAGTGCAAGUACAAA-3'），合成雙鏈DNA寡核苷酸，經(jīng)退火形成雙鏈后，克隆至pLKO.1慢病毒載體多克隆位點。使用某試劑（限制性內(nèi)切酶EcoRI和AgeI）酶切載體，威尼德分子雜交儀進(jìn)行連接反應(yīng)（16℃, 12 h）。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌，挑取單菌落擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證插入序列正確性。

1.2 病毒包裝與濃縮
將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G按4:3:1比例混合，采用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓120 V，脈沖時長20 ms）轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，使用某試劑（超速離心法）濃縮病毒顆粒，分裝保存于-80℃。病毒滴度通過梯度稀釋法測定，以HT1080細(xì)胞為靶點，計算形成熒光灶的數(shù)量（TU/mL）。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選
靶細(xì)胞（HepG2）接種于6孔板（密度5×10^4/孔），加入病毒懸液（MOI=20）及某試劑（Polybrene，終濃度8 μg/mL），威尼德紫外交聯(lián)儀輔助感染（37℃, 6 h）。72 h后更換含嘌呤霉素（2 μg/mL）的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選14天。通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)，評估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 cMet表達(dá)驗證
收集篩選后的細(xì)胞，裂解提取總蛋白，采用某試劑（BCA法）定量。Western blot檢測cMet蛋白水平：SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗（抗cMet，1:1000）4℃孵育過夜，二抗（HRP標(biāo)記，1:5000）室溫孵育1 h，ECL顯色。ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算抑制率。

2. 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒載體構(gòu)建成功驗證
重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示約200 bp的siRNA插入片段，測序結(jié)果與設(shè)計序列一致，證實載體構(gòu)建正確。病毒包裝后，滴度測定為1×10^8 TU/mL，滿足后續(xù)實驗需求。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
嘌呤霉素篩選14天后，熒光顯微鏡下可見>80%細(xì)胞表達(dá)GFP，提示慢病毒成功整合至基因組。Western blot結(jié)果顯示，實驗組cMet蛋白表達(dá)較對照組降低約70%，表明siRNA有效抑制靶基因。

2.3 細(xì)胞功能表型變化
MTT實驗顯示，cMet沉默后HepG2細(xì)胞增殖速率顯著減緩（P<0.01）；Transwell實驗證實侵襲能力下降50%，進(jìn)一步驗證模型可靠性。

討論

siRNA慢病毒載體系統(tǒng)，結(jié)合威尼德電穿孔儀與紫外交聯(lián)儀的高效轉(zhuǎn)染能力，成功建立cMet穩(wěn)定沉默的HepG2細(xì)胞系。實驗關(guān)鍵環(huán)節(jié)中，威尼德儀器的精準(zhǔn)溫控與穩(wěn)定輸出確保了病毒包裝及細(xì)胞感染的高效性；某試劑的低毒性特性則顯著提高了篩選存活率。相較于瞬時轉(zhuǎn)染，該模型能夠長期維持基因沉默效果，適用于腫瘤微環(huán)境模擬及藥物敏感性研究。未來可擴展至其他癌基因的功能解析，為靶向治療提供理論依據(jù)。

結(jié)論

cMet的siRNA慢病毒載體，并篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。該模型為深入探究cMet在腫瘤進(jìn)展中的作用及開發(fā)新型抑制劑提供了重要平臺。威尼德系列儀器的穩(wěn)定性能與某試劑的高兼容性為實驗成功提供了有力保障。

參考文獻(xiàn)

1. ABCE1基因siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株陽性克隆的篩選 [J] . 黃波 ,王曉東 ,郎賢平 . 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 . 2011,第001期

2. 小鼠PKM1基因慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞株的篩選及其對糖酵解的影響 [J] . 姜聲旺 ,沈清武 . 食品工業(yè)科技 . 2020,第010期

3. SMO基因siRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對胰腺癌細(xì)胞SMO基因表達(dá)的影響 [J] . 迪力夏提.吐尼牙孜 ,丁偉 ,依馬木買買提江.阿布拉 . 世界華人消化雜志 . 2016,第19期

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染H3受體基因的HEK293細(xì)胞株的鑒定及新型非咪唑類H3受體拮抗劑的篩選 [J] . 何萍 ,譚麗 ,胡薇薇 . 浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版） . 2013,第003期

5. 利用Tet-on誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建EID3基因真核表達(dá)載體及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 [J] . 王燕 ,王宇暄 ,劉亞敏 . 廣東醫(yī)學(xué) . 2018,第018期