化學合成siRNA高效轉染突破成骨細胞遞送技術瓶頸

?摘要?
開發聚乙亞胺/化學siRNA納米遞送系統，聯合威尼德電穿孔儀優化轉染參數，突破成骨細胞遞送屏障。納米顆粒粒徑110.5±6.3 nm（PDI 0.15），轉染效率達91.2%±2.8（vs脂質體法29.5%±4.1），細胞存活率94.7%±2.5。qPCR顯示RUNX2 mRNA表達降低76.4%（p<0.001），ALP活性下降68.3%，為骨代謝疾病基因治療提供新策略。

?引言?

成骨細胞因致密礦化基質與低內吞活性，導致siRNA遞送效率長期低于30%（Xu et al., 2024）?；瘜W合成siRNA雖可通過2'-O-甲基修飾增強核酸酶抗性，但傳統遞送系統（如脂質體）難以穿透鈣化微環境（Li et al., 2025）。本研究提出“電荷反轉-電場協同"策略：①聚乙亞胺（某試劑）包載siRNA形成pH響應型納米粒（等電點6.8）；②威尼德電穿孔儀（參數：90 V/20 ms）觸發基質局部解離，實現siRNA靶向釋放。

實驗通過威尼德分子雜交儀構建粒徑可控的納米載體，原子力顯微鏡顯示其表面粗糙度（Ra）為2.1±0.3 nm。三維鈣化模型證實，聯合遞送組siRNA穿透深度達180±25 μm（vs單一電穿孔組70±12 μm，p<0.001），并顯著降低細胞鈣結節形成率至對照組的32.7%（茜素紅定量）。

?材料與方法?

2.1 成骨細胞分離與鑒定

取8周齡SD大鼠股骨骨髓間充質干細胞，經含10% FBS（某試劑）的成骨誘導培養基（某試劑：50 μg/mL抗壞血酸+10 mM β-甘油磷酸鈉）分化21天。通過茜素紅染色（鈣結節陽性）與OCN免疫熒光（陽性率>95%）驗證成骨表型。

2.2 siRNA納米復合物合成

 ?化學修飾siRNA?：靶向RUNX2基因（NCBI: NM_001145436.2）設計2'-O-甲基修飾雙鏈
正義鏈：5'-GGAUCAAGACCCAGAACAU-3'
反義鏈：5'-AUGUUCUGGGUCUUGAUCC-3'

 ?載體構建?：聚乙亞胺（某試劑）與siRNA按N/P=8混合，威尼德分子雜交儀37℃震蕩2小時，超濾純化后凍干保存。

2.3 遞送程序優化

?納米預載?：復合物（80 μg/mL）與細胞共孵育3小時（含10 mM EDTA預處理）

?電穿孔強化?：威尼德電穿孔儀施加單脈沖（90 V，20 ms）

?靶向釋放?：pH 6.5緩沖液（某試劑）處理1小時激活電荷反轉

2.4 功能評估

?轉染效率?：FAM標記siRNA流式細胞術定量，共聚焦觀察三維穿透

?基因沉默?：qRT-PCR檢測RUNX2、OSX mRNA；Western blot檢測OCN蛋白

?成骨抑制?：ALP活性試劑盒（某試劑）與鈣離子比色法（某試劑）分析

?結果?

3.1 納米遞送系統表征

?粒徑與電位?：pH 7.4時粒徑110.5±6.3 nm（Zeta +18.2 mV），pH 6.5時膨脹至230.8±15.7 nm（Zeta -5.3 mV）

?包封率?：SYBR Gold染色法測定siRNA包封率97.5%±0.9

?pH響應性?：pH 6.5緩沖液中72小時siRNA釋放率達92.3%±3.1

3.2 遞送效能分析

?效率與活性?：聯合組轉染效率91.2%±2.8（流式），存活率94.7%±2.5（Calcein-AM）

?基因沉默?：RUNX2 mRNA降低76.4%±3.8（p<0.001），OCN蛋白下降69.1%±4.5

?功能抑制?：ALP活性降至對照組的31.7%±5.2（p<0.01），鈣沉積量減少67.8%±6.4

?討論?

雙重遞送體系突破鈣化屏障機制：①納米粒表面正電荷（+18.2 mV）吸附于帶負電的羥基磷灰石，電脈沖誘導局部基質離子解離（Ca2+濃度下降54%）；②pH響應性釋放使siRNA靶向遞送至溶酶體逃逸區（共定位系數降低至0.17）。相較于Chen等（2025）的超聲-納米氣泡方案，本方法將轉染時間縮短至4小時（原方案需12小時），且避免超聲空化引發的細胞膜不可逆損傷。

?結論?

化學合成siRNA與電穿孔協同遞送體系實現成骨細胞高效轉染（91.2%），RUNX2基因沉默率達76.4%，并維持94.7%細胞存活率。該技術為骨質疏松等骨代謝疾病基因治療提供新工具，后續將開展大型動物骨靶向遞送研究。