電穿孔法轉染原代瘢痕疙瘩成纖維細胞條件

細胞來源：手術切除的瘢痕疙瘩組織，取自患者（經患者知情同意）。

主要試劑：DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素 - 鏈霉素雙抗、電穿孔緩沖液、無內毒素的質粒 DNA（含有目的基因，如綠色熒光蛋白 GFP 基因，用于觀察轉染效果）、臺盼藍染液。

實驗儀器：超凈工作臺、CO?培養箱、離心機、倒置顯微鏡、電穿孔儀、細胞培養板、移液器等。

組織處理：將手術切除的瘢痕疙瘩組織置于含雙抗的 PBS 中，沖洗去除血液和雜質。將組織剪成約 1mm3 大小的組織塊，用 0.25% 胰蛋白酶在 37℃消化 30 - 45 分鐘。

細胞接種：消化結束后，加入含血清的培養基終止消化，輕輕吹打組織塊，使細胞分散。將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘，棄上清。用新鮮培養基重懸細胞，接種于細胞培養瓶中，置于 37℃、5% CO?培養箱中培養。

細胞傳代：待細胞融合至 80% - 90% 時，進行傳代培養。用胰蛋白酶消化細胞，按 1:2 或 1:3 的比例接種到新的培養瓶中。取第 3 - 5 代細胞用于電穿孔轉染實驗。

細胞準備：收集對數生長期的原代瘢痕疙瘩成纖維細胞，用胰蛋白酶消化后，離心收集細胞沉淀。用預冷的電穿孔緩沖液重懸細胞，調整細胞密度至 1×10? - 5×10?個 /ml。

DNA 準備：將無內毒素的質粒 DNA 用無菌水稀釋至合適濃度，如 1 - 5μg/μl。

電穿孔操作：取 100μl 細胞懸液與適量的質粒 DNA 混合，輕輕混勻后轉移至電穿孔杯中。將電穿孔杯放入電穿孔儀中，設置不同的電場強度（如 100V/cm、200V/cm、300V/cm）、脈沖時間（如 10ms、20ms、30ms）和脈沖次數（如 1 次、2 次、3 次）進行電穿孔處理。電穿孔結束后，迅速將細胞懸液轉移至含預熱培養基的培養板中，輕輕搖勻。

細胞培養與觀察：將培養板置于 37℃、5% CO?培養箱中培養。在轉染后 24 小時、48 小時和 72 小時，用倒置顯微鏡觀察細胞形態和綠色熒光蛋白的表達情況，評估轉染效率。同時，用臺盼藍染液染色，計算細胞活力。

在不同電場強度下，轉染效率呈現明顯差異。當電場強度為 100V/cm 時，轉染效率較低，GFP 陽性細胞數量較少；隨著電場強度增加到 200V/cm，轉染效率顯著提高，GFP 陽性細胞數量明顯增多；但當電場強度進一步升高到 300V/cm 時，轉染效率并未持續上升，反而出現部分細胞死亡，GFP 陽性細胞數量減少。

脈沖時間對轉染效率也有影響。在較短的脈沖時間（如 10ms）下，轉染效率較低；當脈沖時間延長至 20ms 時，轉染效率有所提高；然而，當脈沖時間達到 30ms 時，細胞毒性明顯增加，轉染效率也未明顯改善。

脈沖次數方面，1 次脈沖時轉染效率相對較低，2 次脈沖時轉染效率有所提高，但 3 次脈沖時細胞死亡率顯著增加，轉染效率并未顯著提升。綜合來看，在電場強度為 200V/cm、脈沖時間為 20ms、脈沖次數為 2 次的條件下，原代瘢痕疙瘩成纖維細胞的轉染效率較高，可達 30% - 40%。

通過臺盼藍染色檢測細胞活力發現，隨著電場強度的增加、脈沖時間的延長和脈沖次數的增多，細胞死亡率逐漸升高。在高電場強度（300V/cm）、長脈沖時間（30ms）和多次脈沖（3 次）條件下，細胞死亡率可超過 50%。而在優化后的條件（200V/cm、20ms、2 次）下，細胞活力仍能保持在 70% - 80%，表明該條件下細胞毒性相對較低。

電場強度是影響轉染效率和細胞毒性的關鍵因素。適當提高電場強度可增加細胞膜的通透性，促進 DNA 進入細胞，但過高的電場強度會對細胞膜造成不可逆損傷，導致細胞死亡。

脈沖時間和脈沖次數也與轉染效率和細胞毒性密切相關。較短的脈沖時間可能不足以使 DNA 有效進入細胞，而過長的脈沖時間和過多的脈沖次數會增加細胞損傷的風險。

此外，細胞密度、DNA 濃度等因素也會對電穿孔轉染效果產生影響。在實驗中發現，細胞密度過低或過高都不利于轉染，合適的細胞密度（1×10? - 5×10?個 /ml）能獲得較好的轉染效果。DNA 濃度過高可能會導致細胞內 DNA 聚集，影響轉染效率，而過低的 DNA 濃度則會使進入細胞的 DNA 量不足，同樣影響轉染效果。