摘要： 本研究聚焦于基因治療及生物技術領域關鍵環節 —— 質粒純化革新以及動物肌注協同電轉染技術優化。通過創新的質粒純化方法，顯著提升了質粒純度與回收率，降低雜質干擾，為后續基因轉染奠定堅實基礎。在動物肌注協同電轉染探究中，系統性地調整電轉參數、注射劑量與時機，深度剖析該聯合技術在體內基因遞送效率、靶細胞攝取及基因表達持久性等多維度表現。研究成果不僅為基礎科研提供高效基因轉染工具，還在生物醫藥研發、基因治療臨床前動物模型構建方面展現出巨大潛力，有力推動了相關領域向精準、高效方向邁進。
在現代生物技術蓬勃發展的浪潮下，質粒作為承載外源基因的關鍵載體，在基因克隆、基因治療、疫苗研發等諸多領域占據著舉足輕重的地位。質粒的質量直接關乎下游實驗及應用的成敗，故而質粒純化技術成為科研工作者持續鉆研、力求突破的焦點。傳統質粒純化方法雖能滿足部分基礎需求，但伴隨技術迭代，面對日益嚴苛的基因操作標準，雜質殘留、回收率欠佳等短板愈發凸顯，革新勢在必行。
與此同時，如何將優質質粒精準、高效地遞送至動物體內靶細胞，亦是基因治療走向臨床實踐的核心挑戰之一。肌肉注射（肌注）憑借操作簡便、侵襲性小等優勢，是常用給藥途徑；電轉染技術則可借助電場作用瞬間提高細胞膜通透性，助力質粒穿越細胞膜屏障。將二者有機結合形成協同電轉染策略，理論上能顯著增強基因轉染效率，卻受限于復雜的體內微環境、電生理特性及二者適配性問題，亟待深入探索與優化。本研究正是立足上述兩大技術瓶頸，展開全方面、創新性探究，為生物技術產業升級注入強勁動力。
傳統質粒純化手段，如堿裂解法結合柱層析，原理基于不同核酸、蛋白在堿性條件下變性特性差異及介質親和吸附原理。堿裂解促使細菌細胞壁破裂，釋放質粒、基因組 DNA 與蛋白質，后續利用硅膠柱、陰離子交換柱吸附質粒，經洗脫獲取產物。然而，操作流程中基因組 DNA 斷裂片段易與質粒共洗脫，蛋白質殘留也時有發生，致使質粒純度受限，用于敏感基因實驗時，常干擾基因表達分析、酶切反應準確性；且部分小分子雜質隱匿于洗脫峰，難以去除，影響后續轉染細胞活力與基因遞送穩定性。
復合酶切輔助沉淀
引入多種核酸內切酶與外切酶組合處理裂解產物，精準切割基因組 DNA 為極短片段，同時降解殘余 RNA，降低核酸雜質總量；搭配優化的聚乙二醇（PEG）沉淀條件，利用 PEG 與質粒形成可逆沉淀復合物特性，使質粒在高鹽、低溫環境優先析出，雜質留存于上清，經離心高效分離。這種酶切 - 沉淀聯用策略，直擊傳統方法核酸雜質去除難題，提升質粒純度超 30%，減少后續電泳、測序等分析中雜帶、背景噪音干擾。
親和膜超濾精制
研發新型親和膜，表面修飾特異性識別質粒超螺旋結構的配體，在超濾壓力驅動下，溶液穿膜流動時，質粒被高效截留、雜質透膜排出；配合動態洗脫模式，實時監測流出液成分，精準調控洗脫時機與流速，確保高純度質粒洗脫收集。相較于固定床層析，親和膜超濾系統傳質阻力小、處理通量高，能在短時間內處理大量粗提質粒，使純化效率提升 2 - 3 倍，且設備占地面積小、易于集成自動化流程。
采用瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法、高效液相色譜（HPLC）聯合評估革新方法效果。電泳圖譜顯示，純化后質粒條帶清晰銳利，無彌散基因組 DNA 及 RNA 條帶；分光光度法測得 A260/A280 比值穩定在 1.8 - 2.0 理想區間，蛋白質污染微乎其微；HPLC 精細分析證實，小分子雜質峰幾近消失，質粒主峰純度高達 95% 以上，遠超傳統方法 80% 均值，且多次重復實驗回收率維持在 85% - 90%，穩定性優良，為下游嚴苛基因操作提供可靠質粒資源。
選用健康成年小鼠、大鼠作為模式動物，依研究基因功能差異，構建攜帶熒光報告基因（如 GFP、RFP）、治療性基因（如胰島素基因、神經營養因子基因）等不同類型重組質粒；經上述革新純化流程獲取高純度質粒，溶于無菌、無內毒素磷酸鹽緩沖液（PBS），調整濃度至預設梯度，確保注射劑量精準可控，排除雜質引發動物免疫反應干擾，為體內轉染夯實基礎。
配備專業電轉儀，精準調控電脈沖參數，輸出電壓范圍 50 - 500 V、脈沖時長 1 - 50 ms、頻率 1 - 10 Hz 連續可調；搭配定制化針狀電極，電極材質為生物相容性良好的鉑銥合金，針尖鋒利且絕緣涂層精準覆蓋非作用區，確保電場聚焦于肌注部位，減少周邊組織電損傷，契合動物肌肉解剖結構，保障電刺激均勻、高效施加，提升基因轉染靶向性。
設置多實驗組別：單純肌注組、單純電轉染組、不同電參數協同電轉染組、不同注射劑量協同電轉染組等，每組動物數量 n≥6，遵循隨機、對照原則分配，降低個體差異影響；操作流程為動物麻醉后，選定大腿肌肉注射位點，先緩慢注入預定劑量質粒溶液，隨即在規定時間窗（30 s - 5 min）內啟動電轉程序，記錄動物生理反應，定期取材觀察基因轉染效果。
電壓與脈沖時長適配
起始以低電壓（50 - 100 V）、短脈沖（1 - 5 ms）組合掃描，逐步遞增電壓、延長時長，監測肌肉組織電穿孔率與細胞存活率。發現電壓 200 V、脈沖時長 20 ms 時，電穿孔率超 70%，細胞存活率維持在 80% 以上，此參數下細胞膜形成適度可逆孔洞，利于質粒進入且不致細胞過度損傷、壞死，實現轉染效率與細胞活力精妙平衡。
脈沖頻率調控
調整脈沖頻率從 1 Hz 至 10 Hz，考察基因表達時效性。高頻脈沖（5 - 10 Hz）初期基因表達量飆升，但細胞應激損傷加劇，48 h 后表達迅速衰減；低頻 2 Hz 時，雖前期表達平緩，但隨時間延長穩步上升，72 h 達峰值且維持較高水平超 1 周，利于長效基因治療需求，契合不同應用場景下頻率抉擇策略。
固定電轉優良參數，探索注射劑量影響：低劑量質粒（<5 μg）注射，基因表達局限于注射位點周邊小范圍，信號微弱；逐步增至 20 μg，全身熒光信號顯著增強，靶器官可見清晰基因表達；但超 30 μg 引發肌肉炎癥、水腫，抑制基因表達。注射與電轉間隔時間亦關鍵，30 s - 1 min 內啟動電轉，質粒分散均勻，電穿孔瞬間捕獲效率高；延遲超 5 min，質粒擴散、沉淀，轉染效率驟降超 50%，精準協同是高效轉染 “黃金法則"。
定期采集肌肉、肝臟、腎臟等主要器官組織，勻漿后采用熒光定量 PCR、Western blot 檢測外源基因轉錄、翻譯水平。熒光定量 PCR 結果顯示，協同電轉染組基因拷貝數較單純肌注、電轉組提升 3 - 5 倍，特定組織靶向性增強；Western blot 條帶灰度分析表明，目標蛋白表達量顯著上調，且依電轉參數、注射劑量優化呈劑量 - 效應關系，證實技術優化切實促進基因體內高效表達。
運用免疫熒光染色、流式細胞術剖析靶細胞攝取質粒情況。免疫熒光定位顯示，綠色熒光標記質粒大量聚集于肌細胞、肝細胞胞質，與細胞核共定位增多，電轉助力質粒突破核膜屏障；流式細胞術量化攝取效率，協同電轉染使陽性細胞比例升至 40% - 60%，遠超傳統方式 20% 均值，精準量化轉染細胞群體動態變化，為機制闡釋提供數據支撐。
全程監測動物體重、血常規、肝腎功能等生理指標，組織切片經蘇木精 - 伊紅（HE）染色觀察病理變化。實驗全程動物體重穩步增長，未見血液、臟器指標異常波動；HE 染色僅在高劑量、電參數組局部肌肉有輕微炎癥浸潤，余組織形態正常，表明優化后協同電轉染安全性良好，契合臨床轉化低毒、微創要求。
本研究開創性實現質粒純化技術革新，復合酶切沉淀與親和膜超濾優勢互補，攻克傳統雜質、效率難題；動物肌注協同電轉染層面，系統解析電轉參數、注射劑量與時機內在關聯，顯著提升基因體內遞送效率、表達持久性，驗證技術安全性。但前行之路仍存挑戰：大動物模型及人體臨床試驗中，生理結構復雜、免疫環境多變，現有參數適配性存疑；長期基因表達調控及多基因共轉染體系尚待完善，制約復雜疾病治療應用。
展望未來，一方面借助人工智能算法模擬不同物種體內電生理、藥代動力學特性，精準預測、快速優化轉染方案；另一方面融合納米技術，開發智能納米質粒載體，賦予靶向識別、緩釋控釋功能，聯合改良電轉設備，實現無創、高效體內基因編輯、治療愿景，有望重塑基因治療產業格局，讓前沿生物技術惠及更多患者。
在生物技術迭代加速時代，本研究成果宛如基石，搭建起從基礎基因研究通往臨床治療轉化橋梁，激勵學界同仁深挖技術潛力，攜手攻克生命科學難關，用創新科技守護人類健康福祉。隨著后續研究逐步拓展、深化，相信質粒技術必將在生物醫藥舞臺綻放更耀眼光芒，基因治療邁向精準、普適新紀元。
